Je suis actuellement en stage de fin d'études dans un laboratoire pharmaceutique, en R&D.
J'ai commencé il y a quelques jours mes manips, après plusieurs semaines de biblio
Pour faire un résumé, je travaille sur un petit peptide que l'on trouve dans la nature. Mon objectif pendant le stage est de purifier ce peptide à partir d'un ultrafiltrat renfermant un nombre indéterminé de molécules.
J'ai été recruté pour investiguer la voie chromatographique, en particulier la chromatographie d'échange d'ions.
(Mon peptide a une bonne stabilité en milieu acide, de plus il possède un pHi d'environ 3)
J'ai donc tout naturellement opté pour une résine cationique forte (SO3H). J'ai commandé plusieurs résines pour déterminer quelle sera la résine sur laquelle mon peptide va le mieux accrocher.
Aujourd'hui, j'ai testé ma première résine qui est vendue sous cette forme : SO3- +Na
J'ai placé un certain volume de résine dans une colonne et j'ai utiliser une solution HCl 2M pour éliminer le sodium et le remplacer par des H+
Juste après cette étape, j'ai fais passer à travers la résine une solution HCl à pH 1.8
[En effet, à un pH < 3, mon peptide possède une seule charge positive (NH3+). J'ai donc décidé de faire la manip' à pH 1.8 pour étudier la fixation du peptide sur la résine. Dans la biblio, ils préconisent de se placer à environ 1 unité de pH en dessous du pHi]
Pour cette première manip', nous avons décidé de faire une cinétique. J'ai donc ajusté le pH de l'ultrafiltrat (qui contient mon peptide) à 1.8 avec HCl pour se placer dans les mêmes conditions que la résine.
Dans un bécher, sous agitation 170rpm, j'ai mis en contact l'ultrafiltrat et ma résine sulfonique (en proportion 1:10 , 10 fois plus de groupements SO3 que de peptide). J'ai prélevé 1mL toutes les 5 minutes, pendant 2 heures pour suivre l'évolution de la concentration de mon peptide d'intérêt.
Le dosage par HPLC a donné les résultats suivants :
- Concentration du peptide à T0 = 4.6 g.L-1
- Concentration du peptide à T5 = 3.0 g.L-1
Puis une diminution continuelle jusqu'à T25 pour arriver à 2.6 g.L-1
Enfin, de T25 à T120, il n'y a absolument aucun changement de la concentration du peptide, hormis des petites augmentations et diminutions successives d'environ 0.300 g.L-1
Hypothèses et questions
1) La résine sulfonique semble épuisée à partir de T25
2) Que pouvez vous me dire sur la vitesse d'agitation? Je pense qu'il y a un problème à ce niveau là..il n'y a peut être pas assez d’interactions entre mon peptide et la résine.
3) Quels conseils pourriez vous me donner pour accrocher une plus grande quantité de peptide sur la résine, je souhaite avoir le meilleur rendement possible.
4) Je pensais remplacer l'HCl par de l'acide sulfurique, qu'en pensez vous?
Le but de cette manip' était d'étudier le comportement du peptide en présence d'une résine cationique forte. Je pense que le test est concluant, il y a bel et bien une interaction.
Merci d'avance à tous les chimistes de ce forum qui auront la gentillesse de me donner des avis sur cette manip' et des conseils pour l'améliorer