Séquençage a grande vitesse, Comment?

[ecolami]

Bonjour,
Je ne suis pas biologiste et je m'étonne que l'on puisse effectuer le séquençage de l' ADN a grande vitesse. Je veux bien que l'automatisation joue un rôle important mais les nombreuses réactions chimiques nécessaires pour déterminer chacune des bases (ou chaque nucléotide) doivent prendre un temps difficilement compressible.
Si j'ai bien compris on commence par découper sélectivement les ADN en morceaux plus petits qui sont séquencés et ensuite (je ne sais trop comment) on arrive par des moyens informatiques a calculer des séquences de recouvrement des morceaux qui permettent de retrouver l'intégralité de l'ADN.

[brusicor02]

Bonjour,

Ah, le séquençage des acides nucléiques, que de méthodes différentes. On est bien loin avec le séquençage haut débit des débuts de Sanger (et son prix Nobel livré avec). a méthode au départ est assez simple : c'est la classique PCR (Polymerase Chain Reaction) qui va dupliquer l'ADN à séquencer, puis avec des billes fonctionnarisé, on s'arrange pour avoir des brins double brin attaché par un bout identique pour toutes les billes. Puis, on nébulise pour avoir des simples brins, qu'on appelle brin matrice. Je vais essayer de t'éclairer sur quelques méthodes pour obtenir la réponse informatique.

- le pyroséquençage : on se base sur ce qu'il se passe lors de l'introduction d'une base par une polymérase : la production d'un pyrophosphate.$$(\text{ADN})_{n} + \text{dDTP} \xrightarrow[]{\text{polymerase}} (\text{ADN})_{n+1} + \text{PPi}$$ L'équation précédente indique qu'on a allongé le complémentaire du brin matrice $(\text{ADN})$ d'une base en produisant notre pyrophosphate $\text{PPi}$.

Maintenant, on cherche à détecter ce pyrophosphate et avoir une réponse proportionnelle à la quantité produite. On utilise pour cela une autre enzyme pour produire de l'ATP, la source chimique d'énergie du vivant : $$\text{PPi} + \text{APS} \xrightarrow[]{\text{sulfurylase}} \text{ATP}$$
Maintenant, reste à transformer cette ATP en signal exploitable. On va utiliser ce que fait le ver luisant : la transformer en lumière : $$\text{luciférine} + \text{ATP} \xrightarrow[]{\text{luciférase}} \text{oxyluciférine} + \text{AMP} + \text{lumière}$$ L'intensité lumineuse sera ainsi proportionnelle au nombre de bases fixées. Il suffit de mesurer cette intensité lumineuse via un capteur CCD.

Maintenant, un petit exemple du processus : j'ai fixé le monobrin matrice à séquencer, j'introduis une à une les $\text{dNTP}$ :

$$ \begin{matrix}
& \, & & \\
\text{T} & \text{G} & \text{A} & \text{A}
\end{matrix} \xrightarrow[]{\text{dATP}} \begin{matrix}
\text{A} & & & \\
\text{T} & \text{G} & \text{A} & \text{A}
\end{matrix} \xrightarrow[]{\text{dCTP}} \begin{matrix}
\text{A} &\text{C} & & \\
\text{T} & \text{G} & \text{A} & \text{A}
\end{matrix} \xrightarrow[]{\text{dGTP}} \begin{matrix}
\text{A} & \text{C} & & \\
\text{T} & \text{G} & \text{A} & \text{A}
\end{matrix} \xrightarrow[]{\text{dTTP}} \begin{matrix}
\text{A} & \text{C} & \text{T} & \text{T} \\
\text{T} & \text{G} & \text{A} & \text{A}
\end{matrix}$$ Et le détecteur voit : $$ \xrightarrow[]{\text{dATP}} I=1 \xrightarrow[]{\text{dCTP}} I=1 \xrightarrow[]{\text{dGTP}} I=0 \xrightarrow[]{\text{dTTP}} I=2 $$ Et c'est ce signal que les programmes interprètent pour faire la séquence.

Cela implique plusieurs choses : la première est d'enlever les excès de nucléotides non incorporés et et l'excès d'ATP non consommé, c'est pourquoi on ajoute une apyrase pour effectuer ce travail. La seconde, c'est que la $\text{dATP}$ est proche de l'ATP et donc pourrait produire un signal parasite, donc on emploie un dérivé $\text{dATP} \alpha \text{S}$ pour la polymérisation du brin matrice.


- la méthode Illumina : cette fois, on utilise des bases modifiées : on leur a greffé un fluorophore, un fluorophore différent pour chaque base, et on a protégé l'extrémité qui permet de poursuivre la polymérisation après cette base. La méthode est simple :
- on fixe les brins sur un support solide fixe
- on applique le mélange des quatre bases : la base complémentaire s'installe
- on lave et on fait une lecture laser pour savoir quelle est la base incorporée
- on déprotège la base et on clive le fluorophore, on est prêt pour un nouveau cycle.

- récemment, on a les méthodes de ligation, proche du pyroséquençage qui permet une meilleure précision en corrigeant les erreurs, mais les brins analysés sont plus courts et les procédures plus longues.

Bref, c'est assez compliqué.

[ecolami]

Bonjour,
Merci pour cette réponse détaillée qui montre un peu la complexité du séquençage.