Activité enzymatique

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Zouzou89
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Activité enzymatique

Messagepar Zouzou89 » 25 Sep 2021, 19:07

Bonjour,

J'ai réalisé un TP d'enzymologie dans lequel nous devions mesurer l'activité enzymatique de différentes fractions contenant une certaine concentration en lysozyme. Pour cela, nous avons mesuré l'absorbance/min puis par différentes formules, nous avons calculé l'activité enzymatique, l'activité totale, l'activité spécifique, le rendement de la purification et le facteur de purification. Cependant, pour certaines fractions, l'absorbance/min est négative ainsi l'activité enzymatique, le rendement, etc sont également tous négatifs mais ce n'est théoriquement pas possible d'avoir une activité, un rendement ou encore un facteur de purification négatif... Dans ce cas-ci, devons nous interpréter les résultats comme s'ils étaient égaux à 0 ?

darrigan
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Re: Activité enzymatique

Messagepar darrigan » 25 Sep 2021, 22:25

Bonsoir,
Il y a peut-être une erreur de calcul ?
Il y a peut-être des valeurs qui ne sont pas significatives car inférieures à l'incertitude de la mesure ?
Il faudrait nous en dire plus : protocole détaillé, tableau de résultats, détail des calculs... pour qu'on puisse se rendre compte.
:salut:
Aide-toi et le forum t'aidera ! :mrblue:

Zouzou89
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Re: Activité enzymatique

Messagepar Zouzou89 » 25 Sep 2021, 23:07

Bonsoir,

Nous avions différentes fractions contenant des concentrations en lysozyme différentes. Nous avons mesuré la DO toutes les 10 secondes pendant une minute. Puis nous avons calculé l'absorbance/min en faisant absorbance à 0s - absorbance à 60s. Ensuite nous avons calculé l'activité enzymatique en divisant l'abs/min par 0,001 (car 1 unité d'activité du lysozyme est égale à la quantité d'enzyme qui provoque une diminution de 0,001 unité d'absorbante) et par le volume de l'échantillon (25 microL). Ensuite, nous avons calculé l'activité totale en multipliant l'activité enzymatique par le volume totale de la fraction. Puis, l'activité totale de la fraction/quantité de protéines qui nous donne l'activité spécifique a été calculé. Enfin, nous avons calculé le rendement de la purification en faisant activité totale de la fraction/activité totale de la fraction F0)x100 puis enfin le facteur de purification en calculant Facteur de purification = activité spécifique de la fraction/activité spécifique de la fraction F0.
Cependant, notre différence d'absorbante étant négative, nous trouvons tous les éléments suivants négatifs...
C'est un peu compliqué de vous résumer le protocole d'un TP de 7h je suis désolée si ce n'est pas très clair :salut:

Zouzou89
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Re: Activité enzymatique

Messagepar Zouzou89 » 25 Sep 2021, 23:15

Bonsoir,

Merci pour votre réponse,

Nous devions tout d'abord purifier le lyzozyme à partir d'un blanc d'oeuf et nous avons obtenu plusieurs fractions contenant des concentrations en lyzozyme différentes. Puis, nous avons doser les protéines par un dosage colorimétrique par la méthode de BRadfort.Grâce à une gamme étalon, nous avons pu déterminer les quantités en protéines dans chaque échantillon. Enfin, nous devions mesurer l'activité enzymatique de chaque fraction. Pour cela, nous avons mesurer la DO toutes les 10sec pendant 1 min de toutes les fractions. 1 unité d’activité du lysozyme est égal à la quantité d’enzyme qui provoque une diminution de 0,001 unité d’absorbance à 450nm/min. Nous avons donc calculer ces différents paramètres :
• Absorbance par minute
Absorbance/min = absorbance mesurée à 0s – absorbance mesurée à 60s
• Activité enzymatique (U/mL/min)
Afin d’obtenir l’activité enzymatique en U/mL/min, on divise l’absorbance/min par 0,001 puis on divise le résultat par 25 µL qui correspondent au volume de fraction utilisé.
• Activité totale de la fraction
Activité totale = activité enzymatique x volume totale de la fraction
• Activité spécifique
Activité spécifique = activité totale de la fraction/quantité de protéines
• Rendement de la purification
Rendement = (activité totale de la fraction/activité totale de la fraction F0)x100
• Facteur de purification
Facteur de purification = activité spécifique de la fraction/activité spécifique de la fraction F0
Cependant, pour certaines fractions, l'absorbance/min est négative, ce qui nous donner tout le reste (activité enzymatique, etc) négatifs également... Et nous ne savons pas comment y interpréter...

J'espère avoir été claire :salut:


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