Accélerer l'évolution

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ecolami
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Accélerer l'évolution

Messagepar ecolami » 15 Mars 2016, 19:18

Bonjour,
Dans une des conférences du professeur Fontecave au Collège de France relative à la mise au point d'enzymes pour des réactions non naturelles liées à la biologie de synthèse et à la chimie verte il explique la stratégie employée avec l'exemple d'un Cytochrome P450 variété ?? '(je ne sais plus).
Une première technique est mise en jeu qui permet de dupliquer les protéines en laissant volontairement des défauts de reproduction (donc le nombre d'acides aminés reste constant). Ensuite une technique de criblage biochimique permet de tester rapidement les enzymes mutées. L'exemple qui était pris avec cette enzyme cytochrome P450 était que la version naturelle oxydes les alcanes (ou plutôt les chaines alcane d'acides gras, sans détruire l'acide) et l'objectif était de modifier assez pour que le METHANE puisse être oxydé en Méthanol. (Dans cette conférence l'objectif avec le méthane n'est pas atteint, ça se limite au propane)
Ce que le criblage révèle est que les mutations utile commencent par rendre de moins en moins sélective l'enzyme, puis il vient un moment ou la sélectivité bascule vers des alcanes a chaines plus courtes.
Ces techniques ne sont possible qu'avec l'automatisation parce que le criblage ne fournit statistiquement que 30% de modifications intéressantes que ces mutations sont soumises de nouveau a une duplication avec mutation qui sera suivie d'un criblage etc...
LEs techniques de diffraction aux rayons X permettent de localiser précisément les mutations (c'est presque de la magie je trouve :bravo: ).
Au départ on pense que les mutations proches du site actif sont les seules importante mais l'expérience montre que ce n'est pas si simple. au fil des mutations loin du site actif apparaissent de temps en temps des enzymes avec des propriétés toutes différentes. Par contre le type de réaction catalysé reste identique.
Unne chose n'est pas claire, pour moi, j'ignore si tout ça est fait dans des bactéries ou s'il faut fabriquer, pièce par pièce les nouvelles enzymes qui ont été sélectionnées: cela est sans doute possible mais excessivement laborieux.
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Re: Accélerer l'évolution

Messagepar brusicor02 » 15 Mars 2016, 21:44

Bonjour,

J'aime bien tes réactions très naturelles écolami. :) Bien entendu que c'est fabriqué par sur-expression dans des bactéries ou d'autres organismes modèles. Fabriquer une protéine par synthétiseur chimique, c'est très coûteux et on va pas aller très loin. :-D Surtout pour un cytochome où on a en plus des éléments hétéroprotéique comme un hème.

Par contre, on appelle pas ça de l'évolution accélérée, mais de l'évolution dirigée. ;-)

La méthode pour produire, c'est toujours la même :
  • créer une séquence
  • synthétiser le brin d'ADN correspondant
  • l'intégrer dans un vecteur d'expression
  • insérer dans E. coli/bactérie/levure/champignon/autres (rayez la mention inutile)
  • faire pousser les cultures et laisser surexprimer dans des réacteurs.

Ensuite, ce qu'on fait concrètement pour l'évolution dirigée :
  1. On choisit une protéine du type qu'on cherche
  2. On crée une librairie de mutants
  3. On fait un "screen" des mutants avec la réaction d'intérêt et on isole les mutants intéressants.
  4. Ensuite, c'est l'heure du choix : soit on a ce qui nous faut et on arrête, soit on reprend les mutants qu'on a obtenu et on refait une librairie avec (retour étape 2).

Si tu m'arrêtes pas, je te récite TOUT mon cours de biocatalyse en synthèse organique. :mrblue:
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Re: Accélerer l'évolution

Messagepar ecolami » 15 Mars 2016, 23:07

Bonsoir,
Merci d'apporter ces précisions.
Dans la conférence il est bien question de mutations statistique suivies de criblage tout cela répété plusieurs fois. Je me doutais bien que ces mutations devaient être faites dans une bactérie, mais cela n'était pas abordé dans cette conférence qui clôt un cycle sur ces thèmes.
La preuve que c'était bien statistique sont les modifications apparues LOIN du site actif et pour lequelles la modification d'efficacité de l'enzyme reste un mystère.
Les conférences du Collège de France http://www.college-de-france.fr/site/ma ... videos.htm celle dont je parle est du 15 Avril 2015 (il y en a deux l'une par le professeur Fontecave, l'autre par une Chercheuse associée, j'ai écouté les deux, c'est captivant!)
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Re: Accélerer l'évolution

Messagepar brusicor02 » 15 Mars 2016, 23:51

Attention, les mutations ne sont pas faite dans les bactéries directement ! La plupart du temps, il s'agit simplement de perturber la PCR (la photocopieuse à ADN) pour qu'elle fasse des erreurs : on choisit une Taq polymérase, qui ne fait pas de relecture, on modifie les concentrations de nucléotides disponibles et des sels, etc. Ensuite, les séquences mutées sont sur-exprimées dans les bactéries.

Il y a d'autres méthodes, comme le DNA shuffling, qui sont des astuces de biochimistes pour faire des mélanges aléatoires encore plus pertinents et faire converger plus rapidement le processus itératif. Les autres méthodes qui sont la conception rationnelle et semi-rationnelle sont moins utilisées mais font rêver : en connaissant la structure et le mécanisme, on prévoit in silico avant de synthétiser l'ADN dans un synthétiseur chimique. Ça a réussi pour la preuve de concept$^{[1]}$, mais c'est TRÈS long et compliqué à mettre en place.

Bibliographie :
$[1]$ J.B. Siegel, A. Zanghellini, H.M. Lovick et al, "Computational Design of an Enzyme Catalyst for a Stereoselective Bimolecular Diels-Alder Reaction", Science. 16 juillet 2010, 329 (5989), p 309-313
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Re: Accélerer l'évolution

Messagepar ecolami » 16 Mars 2016, 01:05

Bonjour,
Les techniques que tu cites ont été évoquées lors de la conférence! :+1:
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