Gradient en HPLC: calcul de la consommation de chaque phase mobile?

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lidwine91
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Gradient en HPLC: calcul de la consommation de chaque phase mobile?

Messagepar lidwine91 » 03 Sep 2020, 12:34

Bonjour,

Je souhaiterai savoir si quelqu'un pourrait m'expliquer comment calculer la quantité consommée lors d'un gradient pour chaque phase mobile (A et B). Autant en isocratique, il n'y a pas de problème, autant en gradient j'ai plus de difficulté.
Vous remerciant par avance pour votre aide,
Bien cordialement,

Lidwine91

Maurice
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Re: Gradient en HPLC: calcul de la consommation de chaque phase mobile?

Messagepar Maurice » 03 Sep 2020, 18:13

Il s'agit de quoi ? D'une réaction chimique ? D'une séparation sur colonne ? C'est la quantité de quoi ? Et comment est-ce qu'on peu "consommer une quantité lors d'un gradient" ? Un gradient ne consomme rien. Et un gradient de quoi d'abord ? Tout cela n'a pas de sens ¨...

lidwine91
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Re: Gradient en HPLC: calcul de la consommation de chaque phase mobile?

Messagepar lidwine91 » 03 Sep 2020, 18:43

Bonjour,

Je me suis peut-être mal exprimée.

C'est de l'HPLC donc une technique séparative sur colonne par définition et il n'y a pas de réactions chimiques (même si je ne comprends pas forcement pourquoi la question a été émise) .

Le but est de déterminer la quantité de phase mobile (le quoi était dans le titre en passant) qui a été utilisée par injection (c'est consommé dans le sens que la phase mobile, une fois que l'analyse est lancée et qu'elle a circulé dans la colonne, elle ira directement dans le bidon de déchets et ne sera pas réutilisée, là encore je ne suis pas chimiste de synthèse donc ce que je considère "consommé" ne correspond pas à deux réactifs qui donne un ou plusieurs produits).

Je ne comprends pas trop la question "un gradient de quoi"? En HPLC on a généralement une à deux phases mobiles (souvent notés A et B). La méthode peut être soit isocratique et donc avec une proportion de phases mobiles fixe (100%A ou x%A et 100-x%B), soit être un gradient qui consiste à augmenter le %B sur un temps donné. Phase mobile A étant la phase aqueuse et la B la phase organique.

En isocratique, il est facile de déterminer le volume de phase mobile utilisé lors de l'injection vu que les proportions sont fixes, en revanche lors d'un gradient, la proportion de B augmente sur un intervalle de temps. D'où ma question, comment puis-je déterminer la quantité totale de phase mobile B utilisée. Actuellement je fais la moyenne du %B max et du %B min pour faire ensuite le même calcul que pour déterminer la quantité de B (mL) pour une méthode isocratique mais je voudrais savoir si c'est juste.

J'espère que je suis maintenant plus explicite.
Très bonne fin de journée,
Bien cordialement,

alexchimiste
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Re: Gradient en HPLC: calcul de la consommation de chaque phase mobile?

Messagepar alexchimiste » 05 Sep 2020, 20:16

Bonsoir,

Maurice est un excellent chimiste, mais je ne pense pas qu'il soit vraiment calé en matière de techniques modernes d'analyse chromatographique, excusez le... On peut être quelqu'un d'hors-pair, il faut savoir ne pas se mettre en avant si on ne sait pas de quoi il s'agit.

La consommation d'éluants d'HPLC en mode gradient c'est pas très compliqué, si tu connais la durée de ton run d'analyse, la proportion d'éluant A et d'éluant B en début et en fin de run, tu peux en déduire la vitesse de changement de composition.

Mettons que tu démarres en eau/acétonitrile 95/5 (colonne phase inverse, évidemment) et que tu finisses en eau/acétonitrile 20/80 au bout d'un temps donné avec un débit donné (en mL/min par exemple)... Le débit est la variable d'importance capitale dans ce type de raisonnement ;-)

En revanche en ce qui concerne une formule toute prête, il doit exister une formule avec des intégrales je pense, mais ça devient un peu trop compliqué à mon goût. Je ne suis pas très porté sur les maths, je suis plutôt chimiste de synthèse :P

Bonne soirée

lidwine91
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Re: Gradient en HPLC: calcul de la consommation de chaque phase mobile?

Messagepar lidwine91 » 06 Sep 2020, 19:55

Bonjour Alexchimiste,

Je vous remercie pour votre réponse.
Je ne me permettrais pas de douter des compétences de Maurice, j'ai parfaitement compris qu'il devait être plus orienté chimie de synthèse que chimie analytique :-).

La vitesse de changement de composition est en effet simple à calculer (%B final - %B inital)/ (t final - t initial) , ce qui correspond à la pente du gradient. Cependant, connaitre la pente ne me permet pas de savoir exactement le % total de B utilisé lors du gradient, seulement le % B par minute.

En isocratique, si j'ai 80%ACN et 20%eau sur un run de 30 min avec un débit de 1 mL/min, pour calculer le %ACN, j'ai juste à faire 1*30*0.8= 24 mL d'ACN
Pour reprendre votre exemple du gradient commençant à 5% d'ACN et finissant à 80% ACN et si je fixe un run de 30 min et un débit de 1 mL/min, j'aurai tendance à faire 1*30*(((80+5)/2)/100) = 12.75 mL d'ACN. Dans cette exemple, la vitesse de changement de %B est (80-5)/30 = 2.5 %ACN/min

J'avoue que les intégrales ne sont pas non plus à mon goût, ça fait trop longtemps que je ne les ai pas utilisé. Est-ce que mon raisonnement précédent est une bonne approximation? J'espère que oui.

Bonne journée


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